非洲猪瘟试剂盒
非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒、
【预期用途】
非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达，我国将其列为一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，并且列入《禁止生物武器公约》核查动物病原体清单。本试剂盒用于对样品中的非洲猪瘟DNA进行快速定性检测，可用于该病毒感染的实验室诊断和现场检测。检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格。
【检测原理】本试剂盒利用实时荧光PCR技术，以非洲猪瘟病毒基因组的高度保守区为靶区域，设计待异性引物及探针，探针标记FAM荧光素，配以TaqDNA聚合酶等成分，使用配套的极速荧光PCR设备进行PCR扩增，从而对样品中非洲猪瘟病毒DNA进行快速定性检测。
【主要组成成份】试剂名称规格样本处理液A1300ul×1管样本处理液B1300ulx1管DNA聚合酶20uL×1管PCR反应液280uL×1管阴性对照200uL×1管阳性对照200uL×1管注：不同批号试剂盒的成份不可以互换使用。
【包装规格】40头份/盒
【储存条件及有效期】
试剂于-20℃储存；反复冻融不超过5次；有效期12个月。
【适用仪器】ZR-LC16/V280/UF-150型做流控极速荧光定量PCR仪。
【样品要求】1.适用标本类型：血液、组织、血粉、饲料等。
2.标本采集与处理
（1）血液样品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混匀，编号备用。
（2）组织样品：用无菌蘑刀和镊子懿取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、扁桃体）约2g，加入10倍体积PBS或生理盐水，于研体或组织匀浆器中充分研磨后转入1.5mL离心管中编号备用。
（3）血粉：同上处理，只不过省掉研磨步骤。
（4）饲料等其它样品：参照专用的商品化提取试剂盒的说明书操作。3.样本的储存样品可立即用于检测，如不能立即检测，在4℃保存不超过24小时，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，反复冻融不超过5次。
【检测方法】
一、病毒DNA的提取
（1）待检样品份数总和用n表示，取n个灭菌的离心管，逐管编号。
（2）每管加入处理液A 30ul。
（3） 每管分别加入已处理的待检样品3ul，充分混匀，18-25℃处理5分钟，旋涡震荡30秒。
（4）每管加入处理液B30pl，震荡混匀，待检。
（5）处理后的样本如在2小时内进行下一步试验，请于4℃保存，如不能立即进行下一步试验，请于-20℃保存。备注：饲料等其它样品，此步骤同样参照专用的商品化提取试剂盒的说明书操作。
二、PCR试剂配置（在试剂准备区进行）及加样（在样品处理区进行）。
1.在试剂准备区，按下列组成配制PCR混合液（n为待测样本数+1阳性对照+1阴性对照）：试剂名称n份用量（10y1体系）PCR反应液7pl xnDNA聚合酵0.5xn（注意：使用前确保PCR反应液和DNA聚合酶充分融化）
2.将PCR混合液按7μl/管分装至PCR反应管中，并移至样品处理区。
3.用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样品、阴性对照、阳性对照各3p分别加到装有PCR混合液的反应管中漩涡混匀、瞬时离心。
4.使用UF-150型号的仪器，各取10μl加入PCR扩增芯片中，盖上芯片膜，移至扩增检测区。使用V280、ZR-LC16型号的仪器，各取8μl加入PCR 扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。
三、PCR扩增检测（在扩增检测区进行）
1.将PCR芯片插入微流控极速荧光定量PCR仪中进行扩增检测。
2.循环参数设定：收集荧光步骤看环数温度（℃）时间（mincsec）信号9501:00否119500:07否2406000:14是
3.仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道。
四、质控标准
1.阴性对照：结果为阴性。
2.阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤33.3.以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
五、结果分析
1.实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值。
2.阀值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线（无规则的噪音线）的点为准。
3.记录仪器自动分析计算出的样品Ct值。
【临界值】本试剂盒的临界值为Ct值=38。
【检测结果的解释】
1. 每次实验均需将试剂盒内的阴性对照、阳性对照与待检样品一同检测，检测结果应符合其性能指标，否则本次实验无效。
2.实验结果判断方法
2.1阴性结果判定：如果样品在FAM通道扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET或者>38.00.
2.2.阳性结果判定：如果样品在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
3.在质控正常的前提下，实验结果判读模式
3.1阳性样品报告格式为：样品检测到非洲猪瘟病毒DNA，浓度高于试剂盒的检测限；
3.2阴性样品报告格式为：样品未检测到非洲猪瘟病毒DNA，浓度低于试剂盒的检测限。